ガラス化

Cryotop®メソッドは、卵子や胚のガラス固化において、市場で最も実証された結果を提供します。Cryotop®、ガラス化および融解メディウム、およびその付属品により、本方法を効率的に適用し、最高の生存率を達成することができます。

ガラス化はARTの実践に革命をもたらし、現在では凍結保存は現在の生殖補助技術の手法に欠かせないものとなっています。

過去20年の間に、ゆっくりとした凍結は、新鮮な胚移植と同等の生存率と臨床結果の改善に関連するため、世界中でガラス化に取って代わられました

ガラス化が導入されて以来、卵巣過剰刺激症候群や多胎妊娠などの患者さんの合併症を心配することなく、凍結胚サイクルの数は世界中で継続的に増加しています。

北里は、ガラス化を推進・向上させる先駆的なブランドの一つとして認識されています。.
この分野での最大の貢献は、有名な Cryotop®法の開発です。

北里Cryotop®法 は、PNから胚盤胞までのすべての段階の卵子や胚を扱うことができます



Ana Cobo博士へのインタビュー:ガラス固化によってクリニックでの仕事の仕方がどのように変わりましたか?

このインタビューでは、IVI Valencia Clinic のCriobiology およびCriopreservation Unitのディレクターであるアナ・コボ博士が、ガラス化によってクリニックでの仕事のやり方がどのように変わったかを語ってくれています。

北里のCryotop®メソッドは、そのユニークな汎用性により、数多くの高効率な凍結保存に使用できる唯一のメソッドです。

胚のガラス化

余剰となったエンブリオ

体外受精が導入された当初は、新鮮な胚の移植が主流でした。しかし、多胎妊娠のリスクを回避し、余剰胚を無駄にしないためにも、凍結保存はARTには欠かせないものとなりました。

周期の区分け

卵巣過剰刺激(OHSS)は、ガラス化によって最小限に抑えられるART合併症の一つです。新生児サイクルで受精卵をすべて凍結し、その後、凍結胚サイクルで移植することで、受精卵移植前に患者さんの体内のホルモンレベルを正常に戻すことができ、OHHSのリスクを減らすことができます。

‘Freeze All’

Freeze All」技術の目的は、子宮内受容性に対するホルモンレベルの悪影響を受けることなく、より良好な子宮内環境で胚を入れ替えることにあります。研究によると、FETを行った場合、新鮮なETと比較して、継続的な妊娠率が大幅に増加しています。

PGT

着床前遺伝子検査では、体外受精の前に、胚に染色体や特定の単原性障害がないかを検査します。そのためには、3日目または5日目に胚を生検する必要があります。PGTプログラムの場合、遺伝子検査の結果を得るための十分な時間を確保するために、生検されたすべての胚を凍結するための適切なガラス化技術を導入することが不可欠です

胚のクライオポーリング

反応の悪い患者さんでは、2-3サイクルの胚をプールして、PGTで移植または検査するのに十分な胚盤胞を集めます

卵母細胞のガラス化

医療上の理由による妊孕性の保存

化学療法や放射線療法は一般的に性腺毒性があり、将来的に早発性卵巣不全を引き起こす可能性があります。 癌に罹患した若い女性は、時間的に余裕があれば、卵子凍結によって生殖能力を維持することができます。癌以外では、予防的卵巣摘出を必要とするBRCA-1およびBRCA-2のキャリア、自己免疫疾患に罹患している方、早発卵巣不全に陥りやすい方などが卵子凍結の候補となります。

社会的理由による妊孕性の保存

卵子の凍結は、キャリアや個人的な理由で妊娠を遅らせたい女性にとって、体内時計が動き出す前に実行可能な選択肢です。また、30歳を過ぎると流産率が高くなるため、卵子を凍結することで、いつでも健康な遺伝子を持った子供を授かることができる可能性があります。

倫理的な理由による妊孕性の保存

現在、胚のガラス化が禁止されている国もあります。このような状況では、余剰胚を廃棄する代わりに、卵子のガラス化が実行可能な選択肢となります。

精子回収なし

採卵日に精子が採取できなかった場合、卵子をガラス化し、後日、精子を採取した際に解凍するか、その後の精巣生検で精子を採取することができます。

ドナー卵子プログラム卵母細胞バンキング

卵子バンクでは、ドナーとレシピエントの間で同期を取る必要がないため、患者の不安を軽減することができます。また、妊娠の結果を損なうことなく、レシピエントがドナーを選択するための幅広い選択肢を提供することができます。

反応が悪い場合の卵母細胞プーリング

卵巣刺激への反応が悪い患者さんには、複数の刺激サイクルから卵母細胞 を集めてガラス化することができます。十分な数の卵母細胞が得られれば、顕微授精を行って十分な数の胚を作ることができ、妊娠率が向上します。

出産を先延ばしにしたい患者さんや医学的な理由で生殖能力を維持したい場合には、卵子をガラス固化することができます。また、ドナーの卵子をガラス固化してバンクに保管することで、レシピエントとのシンクロ率を高めることができます。

さらに、いくつかの研究では、ガラス化後の胚は着床能力を維持できることが示されており、余剰の胚を凍結保存したり、遺伝的結果が得られるまで凍結オールサイクルやPGTのための全胚コホートを作ることができます。

さらに、以前にガラス化された卵子から生成されたガラス化胚を凍結トランスファーしたところ、これらの胚が追加のガラス化プロセスを維持し、健康な赤ちゃんに成長する能力があることが確認されました。PGTの場合、追加の生検が必要となり、そのために再凍結が必要となりますが、二重のガラス化が分娩率に影響を及ぼさないことも示されています。

(1) Cobo A. et al. ガラス化された卵子から開発された胚の凍結移植の結果:二重ガラス化は分娩率に影響しない。http://dx.doi.org/10.1016/j.fertnstert.2013.01.106

液体窒素(LN)に入れると、細胞とその周りの液体溶液は、結晶構造を持たないガラス状のアモルファス固体に変化します

 

ガラス化するためには、高濃度の凍結保護剤(CPA)と非常に高い冷却速度が必要であるが、凍結保存された細胞の最終的な生存率は、試料を冷却する速度よりもむしろ試料を温める速度に依存する可能性があるため、高い温め速度も重要である。

卵子や胚は、LNに投入される前に、細胞に浸透する透過性のCPAのみを含む非滴化CPA溶液(ES-Equilibration Solution)にさらされ、その後、透過性と非透過性のCPAを含むガラス化CPA溶液(VS-Vitrification Solution)にさらされます。

滴下しないCPAにさらされると、細胞は直ちに水分を失って浸透圧を調整し、収縮する。

その後、CPAは、膜の透過性が低いため、よりゆっくりと細胞内に入ります

決められた温度で非滴化溶液にさらされる時間は、CPAの細胞内濃度を決定するため、非常に重要である

ガラス化液により細胞内の脱水が進み、細胞内のCPAが濃縮される。

全体的な目的は、ガラス化されたままの安定した細胞内環境を作ることです

凍結保存中の細胞の生存には、細胞膜を通過する水やCPAの移動が重要であり、その透過性の程度は発生段階によって異なる。

卵母細胞は表面積/体積比が小さく、CPAに対する透過性が低いため、胚に比べて水分を失ったり、CPAを取り込んだりする効率が低く、細胞内で氷ができやすいのです。 平衡化の際にCPAを徐々に添加することで、卵母細胞への十分な浸透が可能となり、より良い生存結果が得られる

細胞膜の透過性は、ガラス化や加温の際の温度によっても変化するため、CPAと水を適切に交換するための重要な要素として考慮する必要があります。

CPAを添加したり、除去したりすると、細胞膜を介して水とCPAが移動するため、収縮と再膨張が連続的に起こる。

北里プロトコールは、細胞の収縮・膨潤ストレスを少なくするように設計されています

凍結保存中の細胞の生存には、細胞膜を通過する水やCPAの移動が重要であり、その透過性の程度は発生段階によって異なる。

卵母細胞は表面積/体積比が小さく、CPAに対する透過性が低いため、胚に比べて水分を失ったり、CPAを取り込んだりする効率が低く、細胞内で氷ができやすいのです。 平衡化の際にCPAを徐々に添加することで、卵母細胞への十分な浸透が可能となり、より良い生存結果が得られる

細胞膜の透過性は、ガラス化や加温の際の温度によっても変化するため、CPAと水を適切に交換するための重要な要素として考慮する必要があります。

CPAを添加したり、除去したりすると、細胞膜を介して水とCPAが移動するため、収縮と再膨張が連続的に起こる。

北里プロトコールは、細胞の収縮・膨潤ストレスを少なくするように設計されています

ガラス化手順

 

リプロプレートは、Cryotop® 法とガラス化を快適に行うために専用に設計された、6つの円錐形のウェルディッシュです。Repro Plateは透明度が高く、視認性に優れています。また、Cryotop®を支えるための2つのスロットがあり、検体を静置してローディングを行いたい方にお勧めです。

各ウェルに300µlの溶液を入れることで、適切な量の培地を使用し、水分の蒸発や浸透圧の変化を最小限に抑えることができ、細胞の破壊を防ぐことができます。さらに、Repro Plateの円錐形のウェルは、卵子のガラス化の際に溶液を段階的に添加することを可能にします(2)。また、底面が平らになっているため、トレーサビリティーラベルを使用することができます

 

卵母細胞と胚は、凍結保護剤(CPA)の濃度を高めた溶液にさらされる。CPAは、細胞内の水分を補い、ガラス状態に移行する際の氷結晶の形成を防ぐ。

試料はCryotop®に載せられ、非常に高い冷却速度でLNに移送される。 Cryotop®は最小容量の装置であり、ガラス化や保存中にLNと直接接触するため、いわゆるオープンシステムとなっている。

ガラス化されたサンプルは、LNまたは窒素の気相で非常に長期間安全に保存することができます。

(2) 凍結保存の主要業績評価指標とベンチマークに関するアルファコンセンサス会議:専門家会議の議事録。 Reprod BioMed Online. 2012 Aug, 25 (2): 146-167.

北里ガラス固化媒体

北里ガラス固化媒体は、HSA(ヒト血清アルブミン)をHPC(ヒドロキシプロピルセルロース)に置き換えて進化したもので、血液製剤からの病原体感染の危険性を排除しています。さらに、トレハロースと組み合わせてHPCを補給すると、ある種の利点があることが示されています(4)。 HPCは溶液に高い粘性を与え、ガラス化が成功する確率を高め、その結果、より良い生存率とさらなる胚の発育を得ることができます。さらに,HPCは加温時に検体をCryotopから容易に離すことができるため,機械的ストレスを軽減し,孵化した胚盤胞でも生存率を高めることができる。

北里ガラス固化媒体は、透過性の凍結保護剤としてDMSOとEGを、非透過性の凍結保護剤としてトレハロースを使用しています。  当社のガラス固化用培地は、DMSOとEGの組み合わせにより、過剰な細胞毒性を回避し、脱水時に卵子や胚にダメージを与える浸透圧を低減しています

(4)Coello A. et al. ヒドロキシプロピルセルロースとトレハロースの組み合わせによるヒト卵子のガラス化のための補充剤:レトロスペクティブコホート研究。 J Assist Reprod Genet. 2016 Mar, 33(3): 413-421.

温める手順としては、リプロプレートに融解媒体をセットします。

Cryotop®は37℃に予熱された最初の温調液に浸され、非常に高い温調速度を実現します。 卵子や胚は、浸透圧ショックを防ぐためにCPAの濃度を徐々に下げながら、異なる溶液にさらされ、良好で安全な細胞の水分補給を可能にします。

北里解凍媒体に含まれる非浸透性の凍結保護剤はトレハロースであり、スクロースに比べて細胞膜を保護する能力が高い。細胞は収縮と膨潤に対して限られた耐性を持っているので、細胞の機能を変化させないために、水分補給のプロトコルでは細胞質の収縮と再膨張を最小限に抑える必要があります。

温める手順としては、リプロプレートに融解媒体をセットします。

Cryotop®は37℃に予熱された最初の温調液に浸され、非常に高い温調速度を実現します。 卵子や胚は、浸透圧ショックを防ぐためにCPAの濃度を徐々に下げながら、異なる溶液にさらされ、良好で安全な細胞の水分補給を可能にします。

北里解凍媒体に含まれる非浸透性の凍結保護剤はトレハロースであり、スクロースに比べて細胞膜を保護する能力が高い。細胞は収縮と膨潤に対して限られた耐性を持っているので、細胞の機能を変化させないために、水分補給のプロトコルでは細胞質の収縮と再膨張を最小限に抑える必要があります。

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